Jensen Ross Ackles est né le 1er mars 1978, à Dallas (Texas). C'est le fils de l'acteur Alan Roger Ackles et Danna Joan Shaffer. Il a des ancêtres Irlandais, Anglais , Ecossais et Français. Il a un grand frère, Joshua, une petite s½ur, Mackenzie et un frère cadet, Yanis.
Il débute très tôt sa carrière artistique en posant pour des photographes dès l'âge de 4 ans, activité qu'il continuera jusqu'à ses 10 ans. En 1996, il obtient son bac au lycée Lloyd V. Berkner de Richardson (Texas), où il joue au base-ball et à la crosse. C'est en participant à une pièce de théâtre au lycée qu'il pense à devenir acteur. Il prend des cours d'art dramatique et s'installe à Los Angeles pour mettre toutes les chances de son côté, accompagné de son petit frère Yanis qui le soutiendra dans tout ce qu'il entreprendra.
En 1997, il décroche le rôle d'Eric Brady dans le feuilleton télévisé Des jours et des vies, qu'il interprète jusqu'en 2000.
En 2001, il joue le personnage de Ben dans un épisode de la saison 1 de la série Dark Angel. Son personnage très apprécié le fera revenir dans toute la saison 2 dans le rôle d'Alec, le clone de Ben.
Après l'annulation de la série, il joue C.J., petit ami de Jen dans la saison 6 de la série Dawson.
En 2004, il intègre l'équipe de la série Smallville qui entame sa quatrième saison. Il y joue Jason Teague, le nouveau petit ami de Lana Lang (Kristin Kreuk) qu'il a rencontrée lors d'un séjour à Paris.
En 2005, il tourne un film d'horreur Le jeu des damnés. Depuis lors, lui et Jared Padalecki jouent Dean et Sam Winchester, deux frères chasseurs de démons. La série cartonne et est renouvelée pour une deuxième, puis une troisième saison et depuis peu pour une quatrième